原核表達

原核表達

標簽: 原核表達 原理 實驗方案

原核表達可以用于檢測(1)發生在原核生物內的基因表達。(2)通過基因克隆技術,將外源目的基因,通過構建表達載體并導入表達菌株的方法,使其在特定原核生物或細胞內表達。

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經驗交流(2

  • PTWIN1做表達載體表達蛋白的問題

    我的表達載體是pTwin1,目的片段和載體均用BamHI 和NruI雙酶切,連接,轉化入T克隆菌,菌液驗證,測序,測序正確;從該菌中提取重組質粒,轉化表達菌BL21,菌液驗證,然后1:100接種搖菌至OD600為0.6左右,加入IPTG 0.5mM,37度誘導,分別1小時,2小時,3小時,4小時,過夜取樣,跑SDS-PAGE,看是否有目的條帶。 pTwin1帶有兩個標簽,但我用酶已經切掉了一個,所以他自身只帶有一個大約24KD的標簽,加上我的目的片段一3KD,大小應該為27KD左右;目的片段二25KD,大小應該為49KD。 我想問 :我的目的蛋白測序正確但好像沒表達,怎么回事呢?我已經做了2個月了,很急,請大家幫忙看看,謝謝了。 ?目的片段一:1為PTWIN1未誘導,2為PTWIN1誘導,3為目的片段未誘導,4-8分別是1h目的片段取誘導樣,2h目的片段取誘導樣,3h目的片段取誘導樣,4h目的片段取誘導樣,目的片段過夜誘導取樣。MARKER是(最上面那根不算,由上到下116,66.2,45,35,25,18.4,14.14)該目的蛋白應在27KD處表達,但仔細看好像沒有表達。

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  • 構建的原核表達載體不表達我的目的蛋白

    換了不同濃度的IPTG,用不同溫度,不同誘導時間都做了,但都沒有我的蛋白,菌落PCR,雙酶切,測序都是對的,為什么不表達呢?

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