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實時熒光定量PCR(realtime PCR)

2元彩票中500万的 www.chmhhq.tw 標簽: 實時 熒光定量 PCR realtime PCR

實時熒光定量PCR可應用于: (1)定量分析未知模板;(2)單個或多個基因表達譜分析。

詳細
實驗方法
  • 實時熒光定量PCR技術
實驗方法原理 實時熒光定量PCR技術,是指在PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程,最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。
實驗材料
試劑、試劑盒
儀器、耗材
實驗步驟
一、 樣品RNA的抽提
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1. ?取凍存已裂解的細胞,室溫放置5分鐘使其完全溶解。
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2. ?兩相分離 每1 ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2 ml的氯仿,蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后,15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12 000 rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相,中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。
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3. ?RNA沉淀 將水相上層轉移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA,混勻后15到30℃孵育10分鐘后,于4℃下12 000 rpm 離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側壁上形成膠狀沉淀塊。
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4. ?RNA清洗 移去上清液,每1 mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1 ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制),清洗RNA沉淀?;煸群?,4℃下7 000 rpm離心5分鐘。
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5. ?RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。
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6. ?溶解RNA沉淀 溶解RNA時,先加入無RNA酶的水4 0ul用槍反復吹打幾次,使其完全溶解,獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。
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二、 RNA質量檢測
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1. ?紫外吸收法測定
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先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋(1:100)后,讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值,測定RNA溶液 濃度和純度。
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?(1)濃度測定
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A260下讀值為1表示40 ug RNA/ml。樣品RNA濃度(μg/ml)計算公式為:A260 x 稀釋倍數 x 40 ug/ml。具體計算如下:
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RNA溶于40 ul DEPC水中,取5 ul,1:100稀釋至495 ul的TE中,測得A260 = 0.21
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RNA 濃度= 0.21 x 100 x 40 ug/ml = 840 ug/ml 或 0.84 ug/ul
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取5 ul用來測量以后,剩余樣品RNA為35 ul,剩余RNA總量為:
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35 ul x 0.84 ug/ul = 29.4 ug
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(2)純度檢測
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RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度,比值范圍1.8到2.1。
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2. ?變性瓊脂糖凝膠電泳測定
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(1)制膠
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1 g瓊脂糖溶于72 ml水中,冷卻至60℃,10 ml的10 x MOPS電泳緩沖液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。

10x MOPS電泳緩沖液
濃度 ?成分
0.4 M ?MOPS,pH 7.0
0.1 M ?乙酸鈉
0.01 M ?EDTA
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灌制凝膠板,預留加樣孔至少可以加入25 μl溶液。膠凝后取下梳子,將凝膠板放入電泳槽內,加足量的1xMOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個毫米。
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(2)準備RNA樣品
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取3 ugRNA,加3倍體積的甲醛上樣染液,加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10 ug/ml。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。
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(3)電泳
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上樣前凝膠須預電泳5 min,隨后將樣品加入上樣孔。5-6 V/cm電壓下2 h,電泳至溴酚蘭指示劑進膠至少2-3 cm。
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(4)紫外透射光下觀察并拍照
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28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃(其大小決定于用于抽提RNA的物種類型),上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍?;褂鋅贍芄鄄斕揭桓齦∩暈⒗┥⒌拇?,它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖體RNA)組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質,可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA制備過程中如果出現DNA污染,將會在28S核糖體RNA帶的上面出現,即更高分子量的彌散遷移物質或者帶,RNA的降解表現為核糖體RNA帶的彌散。用數碼照相機拍下電泳結果。
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三、樣品cDNA合成
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1. ?反應體系
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序號 ? ? ? ? ?反應物 ? ? ? ? ? 劑量
1 ? ? ? ? ?逆轉錄buffer ? ? ? 2 ul
2 ? ? ? ? 上游引物 ? ? ? ? ? ? ?0.2 ul
3 ? ? ? ? 下游引物 ? ? ? ? ? ? ?0.2 ul
4 ? ? ? ? ?dNTP ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.1 ul
5 ? ? ? 逆轉錄酶MMLV ? ? 0.5 ul
6 ? ? ? ? DEPC水 ? ? ? ? ? ? ?5?ul
7 ? ? ? ? ?RNA模版 ? ? ? ? ? ?2 ul
8 ? ? ? ? ? 總體積 ? ? ? ? ? ? ? 10 ul
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輕彈管底將溶液混合,6 000 rpm短暫離心。
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2. ?混合液在加入逆轉錄酶MMLV 之前先70℃干浴3分鐘,取出后立即冰水浴至管內外溫度一致,然后加逆轉錄酶0.5 ul,37℃水浴60分鐘。
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3. ?取出后立即95℃干浴3分鐘,得到逆轉錄終溶液即為cDNA溶液,保存于-80℃待用。
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四、 梯度稀釋的標準品及待測樣品的管家基因(β-actin)實時定量PCR
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1. ?β-actin陽性模板的標準梯度制備 陽性模板的濃度為1011,反應前取3 μl按10倍稀釋(加水27 ul并充分混勻)為1010,依次稀釋至109、108、107、106、105、104,以備用。
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2. ?反應體系如下:
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標準品反應體系
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序號 ? ? ? ? ? 反應物 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 劑量
1 ? ? ? SYBR Green 1 染料 ? ? ? ? ? ? 10 ul
2 ? ? ? 陽性模板上游引物F ? ? ? ? ? ? ?0.5 ul
3 ? ? ?陽性模板下游引物R ? ? ? ? ? ? ?0.5 ul
4 ? ? ? ? ? ? ? ? dNTP ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?0.5 ul
5 ? ? ? ? ? ? ? ? Taq酶 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 1?ul
6 ? ? ? ? ? 陽性模板DNA ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?5 ul
7 ? ? ? ? ? ? ?ddH2O ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?32.5 ul
8 ? ? ? ? ? ? ? 總體積 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?50 ul
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輕彈管底將溶液混合,6 000 rpm短暫離心。
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3. ?管家基因反應體系:
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序號 ? ? ? ? ? ?反應物 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?劑量
1 ? ? ?SYBR Green 1 染料 ? ? ? ? ? ? ? ? ? 10 ul
2 ? ? ?內參照上游引物F ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.5 ul
3 ? ? 內參照下游引物R ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.5?ul
4 ? ? ? ? ? ? ? dNTP ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?0.5 ul
5 ? ? ? ? ? ? ? Taq酶 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 1 ul
6 ? ? ?待測樣品cDNA ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 5 ul
7 ? ? ? ? ? ? ?ddH2O ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?32.5 ul
8 ? ? ? ? ? ? 總體積 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?50 ul

輕彈管底將溶液混合, 6000 rpm短暫離心。
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3. ?制備好的陽性標準品和檢測樣本同時上機,反應條件為:93℃ 2分鐘,然后93℃ 1分鐘,55℃ 2分鐘,共40個循環。
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五、 制備用于繪制梯度稀釋標準曲線的DNA模板
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1. ?針對每一需要測量的基因,選擇一確定表達該基因的cDNA模板進行PCR反應。
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2. ?反應體系
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序號 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 反應物 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?劑量
1 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 10× PCR緩沖液 ? ? ? ? ? ?2.5 ul
2 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? MgCl2 溶液 ? ? ? ? ? ? ?1.5 ul
3 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 上游引物F ? ? ? ? ? ? ? ? 0.5 ul
4 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 下游引物R ? ? ? ? ? ? ? ?0.5 ul
5 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?dNTP混合液 ? ? ? ? ? ?3 ul
6 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?Taq聚合酶 ? ? ? ? ? ? ? 1 ul
7 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? cDNA ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 1 ul
8 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?加水至總體積為 ? ? ? ? ? ? ? 25 ul
?
輕彈管底將溶液混合,6000rpm短暫離心。
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35個PCR循環(94℃1分鐘;55℃1分鐘;72℃1分鐘); 72?C延伸5分鐘。
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(3)PCR產物與 DNA Ladder在2%瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠染色,檢測PCR產物是否為單一特異性擴增條帶。
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(4)將PCR產物進行10倍梯度稀釋: 將PCR產物進行10倍梯度稀釋: 設定PCR產物濃度為1×1010,依次稀釋至109、108、107、106、105、104幾個濃度梯度。
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六、 待測樣品的待測基因實時定量PCR

1. ?所有cDNA樣品分別配置實時定量 PCR反應體系。
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2. ?體系配置如下:
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序號 ? ? ? ? ? ? 反應物 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?劑量
1 ? ? ? ? ? ?SYBR Green 1 染料 ? ? ? ? ? ? ? 10 ul
2 ? ? ? ? ? ? ? ?上游引物 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 1 ul
3 ? ? ? ? ? ? ? ?下游引物 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 1 ul
4 ? ? ? ? ? ? ? ? ?dNTP ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 1 ul
5 ? ? ? ? ? ? ?Taq聚合酶 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 2 ul
6 ? ? ? ? ? ? 待測樣品cDNA ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?5 ul
7 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ddH2O ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?30 ul
8 ? ? ? ? ? ? ? ? ? 總體積 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 50 ul
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輕彈管底將溶液混合,6 000 rpm短暫離心。
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(3)將配制好的PCR反應溶液置于Realtime PCR儀上進行PCR擴增反應。反應條件為:93℃ 2分鐘預變性,然后按93℃ 1分鐘,55℃1分鐘,72℃1分鐘,共40做個循環,最后72℃7分鐘延伸。
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七、 實時定量PCR使用引物列表
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引物設計軟件:Primer Premier 5.0,并遵循以下原則:引物與模板的序列緊密互補;引物與引物之間避免形成穩定的二聚體或發夾結構;引物不在模板的非目的位點引發DNA 聚合反應(即錯配)。
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八、電泳
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各樣品的目的基因和管家基因分別進行Realtime PCR反應。PCR產物與 DNA Ladder在2%瓊脂糖凝膠電泳,GoldView染色,檢測PCR產物是否為單一特異性擴增條帶。
展開 
注意事項

1.熒光閾值:在熒光擴增曲線指數增長長期設定一個熒光強度標準(即PCR擴增產物量標準)。熒光閾值可設定在指數擴增階段任意位置上,但實際應用要結合擴增效率,線性回歸系數等參數來綜合考慮。


2.Ct值:在PCR擴增過程中,擴增產物(熒光信號)到達閾值時所經過的擴增循環次數。Ct值具有極好的重復性。

展開 
其他

實時熒光定量PCR技術有效地解決了傳統定量只能終點檢測的局限,實現了每一輪循環均檢測一次熒光信號的強度,并記錄在電腦軟件之中,通過對每個樣品Ct值的計算,根據標準曲線獲得定量結果。因此,實時熒光定量PCR無需內標是建立在兩個基礎之上的:


1)Ct值的重現性PCR循環在到達Ct值所在的循環數時,剛剛進入真正的指數擴增期(對數期),此時微小誤差尚未放大,因此Ct值的重現性極好,即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內擴增,得到的Ct值是恒定的。


2)Ct值與起始模板的線性關系由于Ct值與起始模板的對數存在線性關系,可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定,因此,實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法。


外標準曲線的定量方法相比內標法是一種準確的、值得信賴的科學方法。利用外標準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準確,重現性最好的定量方法,已得到全世界的公認,廣泛用于基因表達研究、轉基因研究,藥物療效考核、病原體檢測等諸多領域。

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