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PCR擴增產物的克隆

2元彩票中500万的 www.chmhhq.tw 標簽: PCR 擴增 克隆

PCR擴增產物的克隆可以:(1)獲得目的DNA片段;(2)用于原核表達的研究;(3)廣泛應用于分子生物學相關研究。

詳細
實驗方法
  • 平端連接法
  • TA克隆法
實驗方法原理
平頭連接是將制備好的平頭載體和補平或削平的PCR產物直接進行連接。載體可用EcoR V或Sma I切成平頭;PCR產物純化后,可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min(利用該酶所具有的3'→5'外切酶活性和5'→3'的聚合酶活性)。

如果要求不高,PCR產物也可不加處理。如果使用Stratagene公司的pfu DNA聚合酶或New England Biolabs公司的Vent DNA聚合酶,這兩種酶有5'→3'校對能力,擴增出來的PCR產物已經是平頭,可以不作平端處理。平端連接的一個顯而易見的缺陷是連接效率低下,即使使用很高單位的連接酶,或在反應體系中加入PEG 8000,也只能很有限地提高效率。

通常情況下,PCR產物可直接與平端載體DNA進行連接,但其連接效率效低。因為Taq DNA聚合酶具有非模板依賴性末端轉移酶活性,能在兩6條 DNA鏈的3'末端加上一個多余的堿基,使合成的PCR產物成為3'突出一個堿基的DNA分子。

這種DNA分子的連接效率很低。由于PCR產物的效率通過較高,在采用大量T4 DNA連接酶并配以5-10u T4 RNA連接酶時,可顯著提高其連接效率。

對于較短PCR產物,用PUS19的HincⅡ位點進行克隆,以X-gal和IPTG篩選,??傻玫階懔恐刈樽?。另一種提高克隆效率的途徑是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶消去3'末端突出堿基將PCR產物變成平端DNA,然后再用平端連接法克隆PCR產物。
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實驗材料
試劑、試劑盒
儀器、耗材
實驗步驟
一、PCR反應
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1. ?依次混勻下列試劑
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(1)H2O:35 ul
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(2)10×PCR反應緩沖液:5?ul
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(3)25 mmol/L MgCl2:4?ul
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(4) 4種dNTP:4?ul
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(5)上游引物(引物1):0.5?ul
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(6)下游引物(引物2):0.5ul

(7)模板DNA(約1 ng):0.5?ul
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(8)混勻后離心5秒。
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2. ?將混合物在94℃下加熱5分鐘后冰冷,迅速離心數秒, 使管壁上液滴沉至管底,加入Taq DNA聚合酶(0.5 ?ul 約2.5 U),混勻后稍離心,加入一滴礦物油覆蓋于反應混合物上。
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3. ?用94℃變性1分鐘,45℃退火1分鐘, 72℃延伸2分鐘, 循環35輪,進行PCR。最后一輪循環結束后, 于72℃下保溫10分鐘,使反應產物擴增充分。
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二、電泳
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取10 ?ul 擴增產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳分析,檢查反應產物及長度。
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三、PCR產物的純化
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擴增的PCR產物如利用T-Vector進行克隆,可直接使用,如用平未端或粘性未端連接,往往需要將產物純化。
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1. ?酚/氯仿法
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(1)取反應產物加100 ?ul TE。
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(2)加等體積氯仿混勻后用微型離心機10000 rpm離心15秒,用移液器將上層水相吸至新的小管中。這樣抽提一次, 可除去覆蓋在表面的礦物油。
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(3)再用酚:氯仿:異戊醇抽提二次,每次回收上層水相。
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(4)在水相中加300 ?ul 95%乙醇,置-20℃下30 min沉淀。
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(5)在小離心機上10000 rpm離心10 min,吸凈上清液。加入1 ml 70%乙醇,稍離后,吸凈上清液.重復洗滌沉淀2次。將沉淀溶于7 ml ddH2O 中,待用。

2. ?Wizard PCR DNA純化系統
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Wizard PCR DNA純化系統可以快速、有效、可靠地提取PCR擴增液中的DNA,提純后的DNA可用于測序、標記、克隆等。 該系統中含有的試劑和柱子可供50次PCR產物的純化,試劑包括:50 ml Wizard PCR DNA純化樹脂、5 ml 直接提取緩沖液、50支 Wizard微型柱。
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(1)吸取PCR反應液水相放于1.5 ml eppendorf管中。
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(2)加100 ml直接提取緩沖液,渦旋混勻。
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(3)加1 ml PCR DNA純化樹脂,1分鐘內渦旋混合3次。
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(4)取一次性注射器, 取出注塞,并使注射筒與Wizard微型柱連接,用移液槍將上述混合液加入注射筒中,并用注塞輕推,使混合物進入微型柱。
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(5)將注射器與微型柱分開,取出注塞, 再將注射筒與微型柱相連,加入2 ml 80%異丙醇,對微型柱進行清洗。
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(6)取出微型柱置于eppendorf管中,12 000 g離心20秒,以除去微型柱中的洗液。
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(7)將微型柱放在一個新eppendorf管中,加50 ?ul TE或水,靜止1分鐘后,12 000 g離心20秒。
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(8)丟棄微型柱,eppendorf管中的溶液即為純化DNA,存放于4℃或-20℃。
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四、載體加dT尾
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1. ?將1 ug pUC19用SmaⅠ全酶切。
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2. ?在小管中按上述PCR反應,加入各種混合物,除將4 ul 4種dNTP改為4 ul 25 mM dTTP。
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3. ?加入1 ul(5U)的Taq DNA聚合酶在72℃下加熱2 h。
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4. ?按前面三中所述,用酚:氯仿:異戊醇抽提二次。
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5. ?加入2倍體積 95%乙醇,在-20℃下沉淀1 h。
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6、離心,用70%乙醇漂洗后,真空抽干,溶于10ml ddH2O中。
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五、PCR產物與載體粘末端連接
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1. ?在7 ml PCR產物中加1 ml帶dT尾的pUC質粒。
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2. ?加1 ml T4DNA連接酶,1 ml 10×連接緩中液,混勻,16℃連接過夜。
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3. ?取5 ml連接產物轉化感受態細胞并篩選重組子。
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六、PCR產物3'突出端切平及平末端連接
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1. ?在50 ml的PCR產物中,直接加0.5 ml T4 DNA聚合酶混勻。
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2. ?37℃反應10分鐘后,70℃滅活10分鐘。
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3. ?用酚:氯仿抽提2次。
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4. ?乙醇沉淀。沉淀用70%乙醇漂洗后,真空抽干,溶于7 ml ddH2O中。
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5. ?質粒用Smal 切開后,70℃ 15分鐘滅活酶,取1 ml (約0.1 mg)加入上述PCR產物中。加T4 DNA連接酶1 ml ,連接緩沖液1 ml 。
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6. ?取5 ml 連接產物轉化感受態細胞并篩選重組子。
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注意事項
1. ?PCR反應液可直接用于連接,但最好對PCR產物純化后進行連接,既能去掉dNTP與ATP競爭連接酶又能濃縮PCR產物。

2. ?PCR非常靈敏, 操作應盡可能在無菌操作臺中進行。
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3. ?吸頭、離心管應高壓滅菌, 每次吸頭用畢應更換, 不要互相污染試劑。
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4. ?加試劑前, 應短促離心10秒鐘, 然后再打開管蓋, 以防手套污染試劑及管壁上的試劑污染吸頭側面。
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5. ?應設含除模板DNA所有其它成分的負對照。
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6. ?純化樹脂在使用前必須充分混勻。
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7. ?PCR產物中礦物油應盡量吸去,否則會影響提取DNA的 產量。
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其他
一、 PCR反應中的主要成份

1. ?引物
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PCR反應產物的特異性由一對上下游引物所決定。引物的好壞往往是PCR成敗的關鍵。引物設計和選擇目的DNA序列區域時可遵循下列原則:

(1) 引物長度約為16-30 bp, 太短會降低退火溫度影響引物與模板配對,從而使非特異性增高。太長則比較浪費,且難以合成。

(2)引物中G+C含量通常為40%-60%,可按下式粗略估計引物的解鏈溫度 Tm=4(G+C)+2(A+T)。

(3)四種堿基應隨機分布,在3'端不存在連續3個G或C,因這樣易導致錯誤引發。

(4)引物3'端最好與目的序列閱讀框架中密碼子第一或第二位核苷酸對應, 以減少由于密碼子擺動產生的不配對。

(5)在引物內, 尤其在3'端應不存在二級結構。

(6)兩引物之間尤其在3'端不能互補, 以防出現引物二聚體, 減少產量。兩引物間最好不存在4個連續堿基的同源性或互補性。

(7)引物5'端對擴增特異性影響不大, 可在引物設計時加上限制酶位點、核糖 體結合位點、起始密碼子、缺失或插入突變位點以及標記生物素、熒光素、地高辛等。通常應在5'端限制酶位點外再加1-2個?;ぜ罨?。

(8)引物不與模板結合位點以外的序列互補。所擴增產物本身無穩定的二級結構, 以免產生非特異性擴增,影響產量。

(9)簡并引物應選用簡并程度低的密碼子, 例如選用只有一種密碼子的Met, 3'端應不存在簡并性。否則可能由于產量低而看不見擴增產物。
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(10)一般PCR反應中的引物終濃度為0.2-1.0 umol/L。引物過多會產生錯誤引導或產生引物二聚體, 過低則降低產量。利用紫外分光光度計, 可精確計算引物濃度, 在1cm光程比色杯中,260nm下,引物濃度可按下式計算:
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X mol/L= OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)
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X: 引物摩爾濃度,A、C、G、T:引物中4種不同堿基個數。
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2. ?4種三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)

(1)dNTP應用NaOH 將pH調至7.0,并用分光光度計測定其準確濃度。

(2)dNTP原液可配成5-10 mmol/L并分裝,-20℃貯存。一般反應中每種dNTP的終濃度為20-200 umol/L。

(3)理論上4 種 dNTP各20 umol/L,足以在100 ul 反應中合成2.6 ug的DNA。當dNTP終濃度大于50 mmol/L時可抑制Taq DNA聚合酶的活性。4種dNTP的濃度應該相等,以減少合成中由于某種dNTP的不足出現的錯誤摻入。
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3. ?Mg2+

(1)Mg2+濃度對Taq DNA聚合酶影響很大,它可影響酶的活性和真實性,影響引物退火和解鏈溫度, 影響產物的特異性以及引物二聚體的形成等。

(2)通常Mg2+ 濃度范圍為0.5-2 mmol/L.對于一種新的PCR反應,可以用0.1-5 mmol/L的遞增濃度的Mg2+ 進行預備實驗,選出最適的Mg2+濃度。

(3)在PCR反應混合物中, 應盡量減少有高濃度的帶負電荷的基團, 例如磷酸基團或EDTA等可能影響Mg2+ 離子濃度的物質,以保證最適Mg2+ 濃度。
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4. ?模板

(1)PCR反應必須以DNA為模板進行擴增, 模板DNA可以是單鏈分子,也可以是雙鏈分子,可以是線狀分子,也可以是環狀分子(線狀分子比環狀分子的擴增效果稍好)。

(2)就模板DNA而言,影響PCR的主要因素是模板的數量和純度.一般反應中的模板數量為102 -105 個拷貝,對于單拷貝基因,這需要0.1 ug的人基因組DNA,10ng的酵母DNA,1ng的大腸桿菌DNA.擴增多拷貝序列時,用量更少。

(3)靈敏的PCR可從一個細胞,一根頭發,一個孢子或一個精子提取的DNA中分析目的序列。

(4)模板量過多則可能增加非特異性產物。DNA中的雜質也會影響PCR的效率。
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5. ?Taq DNA聚合酶

一般Taq DNA聚合酶活性半衰期為92.5℃ 130 min,95℃ 40 min, 97℃ 5 min。現在人們又發現許多新的耐熱的DNA聚合酶,這些酶的活性在高溫下活性可維持更長時間。

Taq DNA聚合酶的酶活性單位定義為74℃下,30 min,摻入10 nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量。Taq DNA聚合酶的一個致命弱點是它的出錯率,一般PCR中出錯率為2x 10-4 核苷酸/每輪循環,在利用PCR克隆和進行序列分析時尤應注意.在100 ul PCR反應中,1.5-2單位的Taq DNA聚合酶就足以進行30輪循環。

所用的酶量可根據DNA、引物及其它因素的變化進行適當的增減.酶量過多會使產物非特異性增加,過少則使產量降低。

反應結束后,如果需要利用這些產物進行下一步實驗,需要預先滅活Taq DNA聚合酶, 滅活Taq DNA聚合酶的方法有:

(1)PCR產物經酚:氯仿抽提,乙醇沉淀。

(2)加入10 mmol/L的EDTA螯合Mg2+ 。

(3) 99-100℃加熱10 min。目前已有直接純化PCR產物的Kit可用。
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6. ?反應緩沖液

(1)反應緩沖液一般含10-50 mmol/L Tris·Cl (20℃下pH8.3-8.8), 50 mmol/L KCl和適當濃度的Mg2+ 。Tris·Cl在20℃時pH為8.3-8.8,但在實際PCR反應中,pH為6.8-7.8. 50 mmol/L的KCl有利于引物的退火。

(2)反應液可加入5mmol/L的二硫蘇糖醇(DDT)或100 ug/ml的牛血清白蛋白(BSA),它們可穩定酶活性,另外加入T4噬菌體的基因32蛋白則對擴增較長的DNA片段有利。

(3)各種Taq DNA聚合酶商品都有自己特定的一些緩沖液。
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實驗方法原理 TA克隆 系統由Invitrogen公司(San Diego,CA)發展而來的商業性試劑盒,它用于PCR 產物的克隆 和測序。其原理是利用Taq酶能夠在PCR 產物的3'末端加上一個非模板依賴的A,而T載體是一種帶有3'T突出端的載體,在連接酶作用下,可以快速地、一步到位地把PCR 產物直接插入到質粒載體的多克隆 位點(MCS)中。

外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組,這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下,有Mg2+、ATP存在的連接緩沖系統中,將分別經酶切的載體分子與外源DNA分子進行連接。DNA連接酶有兩種:T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。兩種DNA連接酶都有將兩個帶有相同粘性末端的DNA分子連在一起的功能,而且T4噬菌體DNA連接酶還有一種大腸桿菌DNA連接酶沒有的特性,即能使兩個平末端的雙鏈DNA分子連接起來。但這種連接的效率比粘性末端的連接率低,一般可通過提高T4噬菌體DNA連接酶濃度或增加DNA濃度來提高平末端的連接效率。

T4噬菌體DNA 連接酶催化DNA 連接反應分為3 步:首先,T4 DNA 連接酶與輔因子ATP形成酶-ATP復合物;然后,酶-ATP復合物再結合到具有5'磷酸基和3'羥基切口的DNA上,使DNA腺苷化;最后產生一個新的磷酸二酯鍵,把切口封起來。連接反應通常將兩個不同大小的片斷相連。因為DNA片斷有兩個端點,所以切割時出現兩種可能,一種是單酶切,另一種是雙酶切,這兩種酶切方法在基因工程操作中都經常用到。對于單酶切來說,載體與供體的末端都相同,連接可以在任何末端之間進行,這樣就導致了大量的自連接產物。為了減少自環的高本底,可對載體進行5'除磷酸處理,原理是連接酶只能連接DNA片斷的3'OH末端與5'端,所以除磷后載體不會自環。一旦有外源片斷插入時,由外源片斷提供5'端就能與載體進行連接。通過這種方法可大大減少由載體的自環造成的高本底。對于雙酶切來說,無論載體與供體同一片段上都有不同的末端,這樣就避免了載體與供體的自環,能使有效連接產物大大增加。雙酶切的另一個特點是能將供體分子定向連接到載體上。
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連接反應的溫度在37℃時有利于連接酶的活性。但是在這個溫度下粘末端的氫鍵結合是不穩定的。因此采取折中的溫度,即12-16℃,連接12-16h(過夜),這樣既可最大限度地發揮連接酶的活性,又兼顧到短暫配對結構的穩定。Taq DNA酶擴增的PCR產物,其DNA雙鏈前后末端都有一個游離的A堿基,可以與pGEM-T Easy Vector 末端游離的T堿基互補形成環狀重組T質粒。
實驗材料
試劑、試劑盒
儀器、耗材
實驗步驟
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1. ?取大腸桿菌JM109保存液50 ul,接種于4 ml LB(或SOB)液體培養基中,37℃,300 rpm振蕩培養過夜,第二天取50 ul 轉接到新的4 ml LB(或SOB)液體培養基中擴大培養3 h至OD600=0.35~0.4,在無菌操作臺上取1 ml菌液于1.5 ml離心管中,冰浴10 min。
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2. ? 4℃,5 000 rpm離心2 min,去上清液。
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3. ?加入750 ul預冷的0.1 M CaCl2重懸菌體,冰浴30 min。
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4. ? 4℃,5 000 rpm離心2 min,棄上清液。
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5. ?加入100 ul 冰冷的0.1 M CaCl2輕輕重懸菌體,冰浴2 h后,4℃保存備用。
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1. ?將含Amp、X-Gal、IPTG的LB平板37℃預熱。
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2. ? 于100 ul感受態細胞中加入10 ul連接產物,冰浴30 min。
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3. ?將離心管轉入42℃水浴,熱沖擊90秒,然后不要搖動離心管,迅速將其放在冰上2 min。
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4. ?在離心管中加入SOC培養基300 ul,槍頭混勻,37℃、150 rpm溫和搖振60 min。
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5. ?將200 ul 轉化菌液均勻地涂布于含50 mg/ml Amp、20 mg/ml X-gal、200 mg/ml IPTG 的LB平板上,37℃倒置培養過夜,挑選白色菌落進行鑒定。
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三、重組質粒的鑒定
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方案一: 菌落PCR
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(1) 制備PCR混合液。
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(2) 用經滅菌的10 ul 槍頭(不用牙簽)挑去白色菌落,迅速地使挑取物溶在上述混合液中。
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(3) 蓋上離心管得蓋子,在沸水上溫育10 min。
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(4) 將步驟 ⑶ 的樣品冷卻至室溫,離心數秒,然后于管中加入TaKaRa rTaq酶0.25 ul。
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(5) 按以下條件進行PCR反應:94℃預變性3 min;然后進行30個循環反應,其溫度循環條件為:94℃變性1 min,57℃退火1 min,72 ℃延伸1 min;循環結束后72℃再延伸5 min。
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(6) 取5 ul PCR產物在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。
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方案二: 質粒PCR
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1. ?堿裂解法少量制備質粒DNA
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(1)用離心管收集4 ml在LB培養基(含Amp)中培養過夜的菌液,14 000 rpm離心30秒,棄盡上清。
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(2)用250 ul 已加入RNase A1的Buffer S1充分懸浮細菌沉淀。
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(3)加入250 ul Buffer S2,溫和但充分地上下翻轉混合4-6次,此步驟不宜超過5 min。*Buffer S2使用后應立即蓋緊瓶蓋,以免空氣中的CO2中和Buffer S2中的NaOH,降低溶菌效率。
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(4)加入400 ul Buffer S3,溫和地上下翻轉8-10次,室溫靜置2 min,14 000 rpm離心10 min。
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*若離心后凝結塊未沉淀到離心管底部,應再上下翻轉數次,12000g離心3min。
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(5)將DNA-prep Tube置于2-ml Microfuge Tube中,將步⑷中的混合液移入DNA-prep Tube中,5 500 rpm離心1 min。
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(6) 棄濾液,將DNA-prep Tube置回到原2 ml Microfuge Tube中,加入500 ul Buffer W1,5500 rpm離心1 min。
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(7)棄濾液,將DNA-prep Tube置回到原2 ml Microfuge Tube中,加入700 ul 已加無水乙醇的Buffer W2,5 500 rpm離心1 min,以同樣的方法再用700 ul已加無水乙醇的BufferW2洗滌一次。
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(8) 棄濾液,將DNA-prep Tube置回到原2 ml Microfuge Tube中,14 000 rpm離心1 min。
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(9)連濾液一并棄掉收集管,將DNA-prep Tube 置于一新的1.5 ml 離心管中,在silica 膜中央加入25-30 ul Eluent或去離子水。
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(10)室溫靜置2 min,14 000 rpm離心1 min洗脫DNA。
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(11) 取5 uL樣品,1%瓊脂糖凝膠電泳初步篩選重組轉化子。
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2. ?抽提純化質粒DNA酚、氯仿抽提可以去除堿裂解法制備的質粒DNA中殘留的蛋白質。
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(1) 加TE稀釋質粒DNA溶液至300 uL。
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(2)加等體積的酚:氯仿:異戊醇(25:24:1),震蕩混勻,靜置3 min。
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(3)14 000 rpm 離心5 min,吸上清液,加等體積的酚:氯仿:異戊醇(25:24:1),混勻,靜置3 min。
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(4) 14 000 rpm離心5 min,吸上清液,加等體積的氯仿:異戊醇(24:1),混勻,靜置3 min。
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(5) 14 000rpm離心5 min,吸上清液,加2.5倍體積預冷的無水乙醇,混勻后-20℃放置15 min,沉淀質粒DNA。
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(6) 14 000rpm離心13 min,棄上清液,沉淀加入200 uL 70%乙醇洗滌一次,室溫干燥,用20 uL去離子雙蒸水溶解質粒DNA沉淀,-20℃保存待用。
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(7) 取5 ul樣品,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測純化結果。
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3. ?質粒PCR
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(1) PCR反應體系如下:
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(2)PCR 擴增反應條件:94℃預變性3 min;然后進行30 個循環反應,其溫度循環條件為:
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94℃變性1 min,57℃退火1 min,72 ℃延伸1 min;循環結束后72℃再延伸5 min。
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(3) 取5 ul PCR產物于1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測,方法與試驗二相同。
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注意事項
1. ?要獲得目的基因的TA克隆 ,PCR 產物的特異性要好。
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2. ?PCR 產物在TA克隆 前要通過純化。
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3. ?在PCR 產物回收、純化過程中防止外來DNA污染。
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4. ? 制備感受態細胞的全部操作均須于冰浴操作,同時注意近火無菌操作,防止感受態細胞受雜菌污染。
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5. ?42℃熱處理時很關鍵,轉移速度要快,且溫度要準確。
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6. ? 菌液涂皿操作時,應避免反復來回涂布,因為感受態細菌的細胞壁有了變化,過多的機械擠壓涂布會使細胞破裂,影響轉化率。

8. ?Ligation Solution I 請于冰中融解。
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9. ?在進行克隆時,Vector DNA和Insert DNA的摩爾比一般為:1: 2 ~ 10。在本制品中, pMD18-T Vector1 ml (50 ng) 的摩爾數約為0.03 pmol,Control Insert DNA 1ml (50 ng) 的摩爾數約為0.15 pmol。
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10. ?克隆時使用的Insert DNA片段 (PCR 產物) 盡量進行切膠回收純化,PCR產物中的短片段DNA(甚至是電泳也無法確認的非特異性小片段)、殘存引物等雜質都會影響TA克隆的效率。
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11. ?按照本實驗操作進行連接后,直接進行轉化時的連接液不要超過20 ml。當進行轉化的DNA用量較大或準備進行電轉化時,需對連接液進行乙醇沉淀,純化DNA后再進行轉化。
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12. ? 連接反應請在16℃下進行,溫度升高 (>26℃) 較難形成環狀DNA。
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13. ? 連接效率偏低時,可適當延長連接時間至數小時。
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14. ? 感受態細胞可使用適合于pUC系列載體的感受態細胞,如:JM109,DH5a等。
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其他
一、常見問題

1. ?怎樣提高pMD18-T Vector的克隆效率?
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(1) 純化PCR產物,切膠回收的PCR片段最好。
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(2)除去殘存的引物等雜質。
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(3)DNA片段的立體結構、DNA片段的長短都會影響克隆效率。一般情況下,大片段DNA的克隆效率(連接效率與轉化效率)小于短片段DNA,在使用大片段DNA的連接液進行轉化時,建議采用電轉化方法。
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2. ?PCR產物難以插入載體,為什么?
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(1)確認PCR反應使用的DNA聚合酶在PCR產物的3'端是否附加了"A"。有些DNA聚合酶擴增的PCR產物是平端,如使用本公司的Pyrobest DNA聚合酶 (TaKaRa Code: DR005)等擴增得到的PCR產物不能直接用于TA克??;PCR產物保存時間不要過長,長時間保存的PCR產物會脫去末端的"A"堿基。
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(2)PCR產物中短片段雜質DNA太多,這時應切膠回收純化DNA片段,回收時PCR產物不要在紫外線下暴露時間過長。
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(3)確認感受態細胞的轉化效率,使用的感受態細胞的轉化效率最好大于108 cfu/mg pUC118 DNA。
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(4)確認Ligation Solution I 的連接效率是否降低,多次反復凍融會降低的Ligation Solution I 連接效率。
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(5)確認抗生素的濃度是否過大。
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(6)最好使用新配制的平板培養基。
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3. ?轉化后的菌落全為藍色 (或淡藍色),為什么?
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插入的PCR片段較短(小于500 bp),且插入片段沒有影響lacZ基因的讀框時,平板培養基上出現的菌落有可能呈現藍色。
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4. ?插入的PCR產物進行測序時,可使用何種引物?
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本制品的載體來源于pUC18載體。因此,用于pUC18載體測序的引物都可以使用。
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  • dxy_2uv4hcg8

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    3個月前 覺得難

    123123

  • wangyan_456

    wangyan_456

    3個月前 覺得簡單

    這個實驗這要是流程比較長,還挺簡單。

  • dxy_7cwp8wm5

    dxy_7cwp8wm5

    3個月前 覺得一般

    基本實驗,沒什么難度吧

  • jiangshi900115

    jiangshi900115

    3個月前 覺得一般

    不難,但必學

  • lilinling203

    lilinling203

    3個月前 覺得一般

    做過,根據老師寫的一步步來就行

  • dreamman882000

    dreamman882000

    3個月前 覺得一般

    先學好PCR

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