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逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR,rtpcr)

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逆轉錄

RT-PCR 聚合酶鏈反應

逆轉錄-聚合酶鏈反應可應用于:(1)分析基因的轉錄產物;(2)獲取目的基因;(3)合成cDNA探針;(4)構建RNA高效轉錄系統。

詳細
實驗方法
  • RT-PCR技術
實驗方法原理

提取組織或細胞中的總RNA,以其中的mRNA作為模板,采用Oligo(dT)或隨機引物利用逆轉錄酶反轉錄成cDNA,再以cDNA為模板進行PCR擴增,從而獲得目的基因或檢測基因表達。

實驗材料
試劑、試劑盒
儀器、耗材
實驗步驟

一、總RNA的提取
見?總RNA的提取?相關內容。
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二、cDNA第一鏈的合成

目前試劑公司有多種cDNA第一鏈試劑盒出售,其原理基本相同,但操作步驟不一。現以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System? for First Strand cDNA Synthesis 試劑盒為例。
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1.?在0.5 ml微量離心管中,加入總RNA 1-5 ug,補充適量的DEPC H2O使總體積達11 ul。在管中加10 uM Oligo(dT)12-18 1 ul,輕輕混勻、離心;
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2.70℃加熱10min,立即將微量離心管插入冰浴中至少1min;
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3.?取0.5 ml PCR管,依次加入下列試劑:第一鏈cDNA? ?2 ul;上游引物(10 pM) 2 ul;下游引物(10 pM) 2 ul;dNTP(2mM) 4 ul;10x PCR buffer 5 ul;Taq 酶(2 u/ul) 1 ul。輕輕混勻,離心。42℃孵育2-5 min;

4.加入SuperscriptⅡ1 ul ,在42℃水浴中孵育50 min;
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5.?于70℃加熱15 min以終止反應;
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6.將管插入冰中,加入RNase H 1 μl ,37℃孵育20 min,降解殘留的RNA。-20℃保存備用。
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三、PCR

1.取0.5 ml PCR管,依次加入下列試劑:第一鏈cDNA ? 2 ul;上游引物(10 pM)2 ul;下游引物(10 pM)2 ul;dNTP(2 mM) 4 ul;10x PCR buffer 5 ul;Taq 酶(2 u/ul)1 ul;
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2.加入適量的ddH2O,使總體積達50 ul。輕輕混勻,離心;
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3.設定PCR程序。在適當的溫度參數下擴增28-32個循環。為了保證實驗結果的可靠與準確,可在PCR擴增目的基因時,加入一對內參(如G3PD)的特異性引物,同時擴增內參DNA,作為對照;
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4.電泳鑒定:行瓊脂糖凝膠電泳,紫外燈下觀察結果;
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5.密度掃描、結果分析:采用凝膠圖像分析系統,對電泳條帶進行密度掃描。
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注意事項

1.在實驗過程中要防止RNA的降解,保持RNA的完整性。在總RNA的提取過程中,注意避免mRNA的斷裂;
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2. 為了防止非特異性擴增,必須設陰性對照;
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3.內參的設定:主要為了用于靶RNA的定量。常用的內參有G3PD(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)、β-Actin(β-肌動蛋白)等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應體系中擴增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差;
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4. PCR不能進入平臺期,出現平臺效應與所擴增的目的基因的長度、序列、二級結構以及目標DNA起始的數量有關。故對于每一個目標序列出現平臺效應的循環數,均應通過單獨實驗來確定;
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5. 防止DNA的污染: 采用DNA酶處理RNA; 在可能的情況下,將PCR引物置于基因的不同外顯子,以消除基因和mRNA的共線性。

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其他

1.反轉錄酶的選擇
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(1) Money 鼠白血病病毒(MMLV)反轉錄酶:有強的聚合酶活性,RNA酶H活性相對較弱。最適作用溫度為37℃;
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(2)禽成髓細胞瘤病毒(AMV)反轉錄酶:有強的聚合酶活性和RNA酶H活性。最適作用溫度為42℃;
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(3)Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜熱微生物的熱穩定性反轉錄酶:在Mn2+存在下,允許高溫反轉錄RNA,以消除RNA模板的二級結構;
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(4)MMLV反轉錄酶的RNase H-突變體:商品名為Superscript 和SuperScriptⅡ。此種酶較其它酶能多將更大部分的RNA轉換成cDNA,這一特性允許從含二級結構的、低溫反轉錄很困難的mRNA模板合成較長cDNA。
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2.合成cDNA引物的選擇
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(1) 隨機六聚體引物:當特定mRNA由于含有使反轉錄酶終止的序列而難于拷貝其全長序列時,可采用隨機六聚體引物這一不特異的引物來拷貝全長mRNA。用此種方法時,體系中所有RNA分子全部充當了cDNA第一鏈模板,PCR引物在擴增過程中賦予所需要的特異性。通常用此引物合成的cDNA中96%來源于rRNA。
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(2) Oligo(dT):是一種對mRNA特異的方法。因絕大多數真核細胞mRNA具有3'端Poly(A+)尾,此引物與其配對,僅mRNA可被轉錄。由于Poly(A+)RNA僅占總RNA的1-4%,故此種引物合成的cDNA比隨機六聚體作為引物和得到的cDNA在數量和復雜性方面均要小。

(3)特異性引物:最特異的引發方法是用含目標RNA的互補序列的寡核苷酸作為引物,若PCR反應用二種特異性引物,第一條鏈的合成可由與mRNA 3'端最靠近的配對引物起始。用此類引物僅產生所需要的cDNA,導致更為特異的PCR擴增。

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