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酵母感受態細胞制備實驗

2元彩票中500万的 www.chmhhq.tw 標簽: 酵母 感受態細胞 制備

酵母感受態細胞制備可應用于:(1)建立酵母轉化體系;(2)酵母表達系統構建;(3)酵母其他分子生物學研究。

實驗方法
  • 化學法
  • 試劑盒制備法
實驗方法原理 感受態是受體最容易接受外源DNA片段并實現轉化的一種生理狀態,用對應化學物質處理細胞后,細胞逐漸形成感受態細胞并進行轉化?;Х虻?,快速,穩定,重復性好,廣泛用于外源基因的轉化。
實驗材料
試劑、試劑盒
儀器、耗材
實驗步驟
一、試劑與耗材

1. ?試劑
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細菌用-酵母提取物(Fisher)、?細菌用-蛋白胨(Fisher)、葡萄糖(Fisher)、細菌用-瓊脂粉、去離子水、甘油(Sigma)、二甲基亞砜(Sigma)、聚乙二醇3350(Sigma)、醋酸鋰(Sigma)、鮭魚精子細胞DNA(Invitrogen)、酵母無氨基酸氮源(Sigma)、?2-(N-嗎啉代) 乙磺酸、腺嘌呤(Sigma)、葡萄糖。
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2. ?儀器
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水浴鍋(VWR)、離心機(Eppendorf)、30℃搖床與恒溫培養箱(VWR)、培養皿。

二、 試劑配方
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1. ?YPDA液體或固體培養基
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(1)1%酵母提取物: 10 g/L
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(2)2%胰蛋白胨: 20 g/L
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(3)2%葡萄糖:20 g/L
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2. ?轉化液
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(1)聚乙二醇3350(50 % (w/v):260 ul
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(2)1 M醋酸鋰:36 ul
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(3)SsDNA(10 mg/ml):10 ul
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(4)質粒:3 ul
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(5)總計:360 ul
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3. ?YNB+ MA 培養基(100 ml)
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(1)YNB:0.67 g
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(2)2-(N-嗎啉代) 乙磺酸(20mM ):0.39 g
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(3)腺嘌呤:0.01 g
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(4)瓊脂粉:2g
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(5)葡萄糖:2g
三、制備步驟
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1. ?在轉化實驗的兩天前,于YPDA培養基的平皿上活化酵母菌株。
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2. ? 轉化前一天,挑取活化的酵母細胞(單克?。┯赮PDA液體培養基中,30℃,200 rpm培養過夜。
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3. ?將培養過夜的酵母細胞液按1:3的比例轉接與新的YPDA液體培養基中,于30℃搖床內,200 rpm培養4 h。
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4. ?3 000 g 離心 5分鐘收集酵母細胞,用0.5倍體積的無菌水洗酵母細胞。
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5. ?再次3 000 g 離心 5分鐘。
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6. ?用0.01倍體積的無菌水重懸酵母細胞,并轉入適宜的離心管中,20℃,3 000 g 離心 5分鐘。
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7. ?用0.01倍體積的無菌細胞懸浮液(5 % v/v 甘油,10% v/v 二甲基亞砜)重懸酵母細胞。
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8. ?將重懸的酵母細胞按50 ul分裝到1.5 ml離心管中。
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9. ?將管放入塑料盒或者紙盒中(逐步梯度冷凍能夠增強酵母的存活率)。
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10. ?將裝有酵母細胞的盒子放入-80℃冰箱。(細胞在-80℃能夠保存一年以上)。
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? ? ?
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其他

一、化學法試劑配方:

1.? YPDA液體或固體培養基

?

(1)1%酵母提取物: 10 g/L

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(2)2%胰蛋白胨: 20 g/L

?

(3)2%葡萄糖:20 g/L

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2.? 轉化液

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(1)聚乙二醇3350(50 % (w/v):260 μl

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(2)1 M醋酸鋰:36 μl

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(3)SsDNA(10 mg/ml):10 μl

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(4)質粒:3 μl

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(5)總計:360 μl

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3.? YNB+ MA 培養基(100 ml)

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(1)YNB:0.67 g

?

(2)2-(N-嗎啉代) 乙磺酸(20mM ):0.39 g

?

(3)腺嘌呤:0.01 g

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(4)瓊脂粉:2g

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(5)葡萄糖:2g


、參考文獻
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1. ?Gietz R.D., Schiestl R.H. (2007). Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat Protoc 2(1): 1-4.
?
2. ? Lu Y., Chanroj S., Zulkifli L., Johnson M.A., Uozumi N., Cheung A., Sze H. (2011). Pollen tubes lacking a pair of K+ transporters fail to target ovules in Arabidopsis. Plant Cell 23(1): 81-93.
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實驗方法原理

酵母化學感受態細胞制備試劑是一種通過化學處理,高效快速制備釀酒酵母化學感受態細胞,用于長期凍存以備后續轉化的產品。

實驗材料
試劑、試劑盒
儀器、耗材
實驗步驟
一、挑取酵母受體菌的新鮮的單菌落(4℃放置不超過3周的也可以),接種到裝在50 mL 離心管中的10 mL的自備的YPD培養基中。
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二、30℃搖晃培養,搖床速度250 rpm/分鐘,直到OD600達到0.6-1.0(相當于0.6-1x107細胞/mL)。
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三、室溫3 000 rpm離心5 min,棄上清得酵母細胞沉淀。
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四、新鮮制備適量的酵母感受態制備工作液。對10 mL酵母需要5.25 mL的工作液,其配制方法是:將4.75 mL制備液A、0.25 mL制備液B和0.25 mL制備液C加入到一個無菌的離心管中后充分震蕩混勻即可。酵母感受態制備工作液可放室溫待用。
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五、用0.5倍體積的新鮮配制的酵母感受態制備工作液洗滌酵母細胞沉淀一次(對10 mL酵母則需要5 mL酵母感受態制備工作液)。即混合后振蕩1分鐘,室溫3 000 rpm離心3分鐘,去上清得洗滌后的酵母細胞沉淀。
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六、再用0.02倍體積的酵母感受態制備工作液充分重懸菌體(對10 mL酵母,則需要0.2 mL酵母感受態制備工作液)。
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七、按每管0.2 mL分裝到冷凍管中,放入保溫冰盒中冷卻半小時后再放入-80℃冰箱待用。0.2 mL的感受態細胞足夠1次轉化使用。
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注意事項

放入保溫冰盒的目的是使溫度緩慢下降,急凍將使轉化效率降低,這點跟大腸桿菌感受態制備過程不同。

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