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各種染色方法大薈萃

2元彩票中500万的 www.chmhhq.tw 關鍵詞: 多種染色方法 總結 2015-07-03 16:53 來源:丁香園論壇 點擊次數:21222

按首字母排序(A-V)

【A】

AgNOR 染色法:

1、試劑配制:

(1)AgNOR 染色液:

甲液:明膠 2 g 溶于雙蒸水至 99 ml,在 60℃ 使之完全溶解,再加入純甲酸 1 ml 搖勻待用。

乙液:硝酸銀 50 g 溶解于雙蒸水中至 100 ml,4℃ 冰箱保存。

(2)AgNOR 工作液

取甲液 10 ml,乙液 20 ml 臨用前混合。

2、步驟:

(1)切片脫蠟至水

(2)雙蒸水洗 2 次

(3)AgNOR 工作液中(25℃)浸染 30 分鐘(暗處進行)(鏡下觀察)

(4)雙蒸水洗 3 次

(5)脫水, 透明, 封固

3、結果:油鏡觀察,細胞核及胞質背景為淡黃色, AgNOR 呈棕黑色顆粒狀。

【B】

鞭毛染色法:

1.試劑配制:

甲液:丹寧酸 5克,氯化鐵(FeCl3)1.5克,福爾馬林(15%)2.0毫升,氫氧化鈉(NaOH)1% 1.0毫升

乙液:硝酸銀(AgNO3)2克

蒸餾水 100 毫升

制備乙液時,待硝酸銀溶解后,取出10毫升備用,向余下的90毫升硝酸銀液中滴加濃氫氧化銨,先呈很濃厚的沉淀,再繼續滴加至剛剛溶解沉淀成澄清液為止。再將備用的硝酸銀溶液慢慢逐滴加入澄清液中,先呈現薄霧,但輕搖則消失,繼續邊滴加邊搖動,待澄清液呈現略有輕微不消散的薄霧狀為止。如霧重,則銀鹽沉淀,不宜使用。

2.染色方法:

(1)將待檢菌接種在新制備的肉湯瓊脂斜面上,置37°培養16—20小時,備用。

(2)在載玻片的中部相隔一厘米處,用接種環各沾一滴蒸餾水,然后用接種環挑取濕潤處的菌苔少許于一端的水滴中,傾斜玻片使培養物流至另一水滴中,兩水滴自然相通,菌體從上位自然擴散到下位水滴中,待干燥后染色。

(3)在干燥涂片上加甲液3—5分鐘,用蒸餾水沖洗。將殘水瀝干或用乙液沖去殘水后,加適量乙液保持30—60秒鐘。染色時在酒精燈上稍加熱,使染液出現蒸汽即可,用蒸餾水沖洗。

(4)鏡檢:菌體及鞭毛皆染成茶色。

3.注意事項:

(1)染液最好隨用隨配,存放至次日效果則差。

(2)一定要充分洗凈甲液后再加乙液,否則背景較臟。

(3)防止水及培養物沾有氯化物。

(4)切忌用接種環涂抹培養物。

(5)載玻片一定要洗凈。先用洗衣粉煮沸,再水洗,干后放在洗液中,浸泡 24 小時,取出水洗除去殘酸,瀝干,存放于95% 乙醇中備用。

(6)加熱時最好置金屬板上,使載玻片受熱均勻。

β-半乳糖苷酶可以催化二糖乳糖水解為單糖:葡萄糖和半乳糖。

β-半乳糖苷酶的活性可以用 X-gal(5-溴-4-氫-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)等顯色底物加以檢測,β-半乳糖苷酶可將 X-gal 轉變為不溶性的深藍色沉淀。

X-gal 可以做為組織染色劑,可以在所有表達β-半乳糖苷酶的植物和動物組織上產生顏色。

應該是可以用來病毒感染組織切片染色的。

【C】

CAE 染色步驟

1、試劑配制:

(1)A 液:萘酚-AS—D 氯醋酸 10 mg 溶于 N,N-二甲基甲酰胺 1 ml 中。

(2)4% 副品紅液:取鹽酸副品紅 (EM 級)1 g,溶于蒸餾水 20 ml 內,再加入 10m1/L 的 HCl 5m1,稍加溫以增加溶解度,過濾、貯室溫下。于使用前,取等量副品紅液與新鮮的 4% 亞硝酸鈉混合,之后用淀粉碘化物試紙測試,瞬間試紙應變為藍色才合格,如果不變色,應加入更多的亞硝酸鹽。

(3)B 液:o.1mol/L 的 Michaelis Veronal-醋酸緩沖液 (PH 7.6)30 ml,加入新配制的副品紅液 3 滴,用 1moI/L HCl 使 PH 值調至 6.3。

2、染色步驟:

(1)將 A.、B 二液混合,過濾,加入氟化鈉 (17 mg/10 ml), 使之最后濃度為 0.04mol/L.

(2)切片置于上述溶液內孵育 1 h(30℃)

(3)流水沖洗。

(4)蘇木素復染。

(5)空氣干燥后封固。

【G】

Grimelius 硝酸銀反應法(嗜銀反應):

1、試劑配制:

硝酸銀液: 1% 硝酸銀水溶液 3 毫升 蒸餾水 87 毫升

0.2M 醋酸緩沖液 (PH5.6) 10 毫升

還原液: 對苯二酚 1 克 亞硫酸鈉 5 克 蒸餾水 100 毫升

2、染色步驟:

(1)切片脫蠟至蒸餾水

(2)60℃ 硝酸銀液內 3 小時

(3)用濾紙吸去周圍銀液, 蒸餾水速洗

(4)入 45℃ 的還原液處理 1 分鐘

(5)蒸餾水洗

(6)5% 硫代硫酸鈉處理 1 分鐘 (可不做)

(7)水洗, 脫水, 透明, 封固

3、結果:嗜銀顆粒呈棕黑色。正常時嗜銀顆粒存在于神經內分泌細胞,故此法主要用于神經內分泌腫瘤的診斷。

【H】

HID 染色法

1、染色步驟:

(1)切片脫蠟至蒸餾水

(2)放入預熱的 1 當量鹽酸中 10 分鐘

(3)蒸餾水洗

(4)Schiff 液中染 10 分鐘

(5)自來水洗 15 分鐘至細胞核紅色(如 2~5 步不做,可在染好愛先藍后染核固紅 2 分鐘)

(6)蒸餾水洗

(7)高鐵二胺液 18~24 小時

(8)愛先藍液 (pH2.5) 染 10~20 分鐘

(9)蒸餾水洗

(10)脫水, 透明, 封固

2、結果:

硫酸化酸性粘液呈棕黑色, 羧基化酸性粘液(唾酸粘液)物質藍色。硫酸化酸性粘液可見于大腸粘膜,而小腸粘膜僅出現唾酸粘液,此法多用于確定腸化的分型。

HP(硝酸銀法)

1、試劑配制:

(1)醋酸緩沖貯備液,PH3.6

0.2N 醋酸緩沖液,PH3.6 10 ml

蒸餾水 240 ml

以下各液均用此液配制

(2)1 % 硝酸銀液

硝酸銀 1 g

醋酸緩沖貯備液,PH3.6 100 ml

(3)2 % 硝酸銀液

硝酸銀 0.2 g

醋酸緩沖貯備液,PH3.6 10 ml

(4)5 % 明膠液

明膠 5 g

醋酸緩沖貯備液,PH3.6 100 ml

先把醋酸緩沖貯備液加溫至 40℃ 左右,然后傾入明膠,于 37℃ 溫箱內慢慢溶解,攪拌。

(5)3 % 對苯二酚液

對苯二酚 0.3 g

醋酸緩沖貯備液,PH3.6 10 ml

(6)明膠對苯二酚液

3 % 對苯二酚液 1 ml

5 % 明膠液 15 ml

(7)顯影液

明膠對苯二酚液 16 ml

2 % 硝酸銀液 3 ml

在操作到第 4 步完成前 5 分鐘充分混合,置于 56℃ 水浴箱中保溫待用。

2、操作方法:

(1)組織脫蠟至蒸餾水

(2)醋酸緩沖貯備液洗 2 次

(3)入 1 % 硝酸銀液中,56℃,1 小時

(4)切片不水洗,直接放入預熱的顯影液中 56℃,肉眼呈黃棕色為止。

(5)傾去顯影液,于 56℃ 的水中浸洗 2 分鐘

(6)水洗

(7)脫水,透明,封固。

3、結果:幽門彎曲菌呈棕黑至黑色。

Highman 甲醇剛果紅染色法(類淀粉染色)

1、試劑配制:

甲醇剛果紅染液: 剛果紅 0.5 g 甲醇 80 ml 甘油 20 ml

堿性乙醇分化液: 氫氧化鉀 0.2 g 80% 乙醇 100 ml

2、染色步驟:

(1)切片脫蠟至水

(2)甲醇剛果紅染液染 10~20 分鐘

(3)用堿性乙醇分化液分化數秒

(4)水洗

(5)蘇木素復染 2 分鐘

(6)水洗

(7)脫水, 透明, 封固

3、結果:淀粉樣物呈桔紅色。

4、類淀粉染色的應用:

確定淀粉樣變性及玻璃樣變性的膠原組織,后者在剛果紅法染色后呈淡桔色,常用于診斷甲狀腺髓樣癌和胰島細胞瘤等。

【L】

六胺銀染色法

1、試劑配制:

六胺銀液配制:

3% 六次甲基四胺水溶液 5 ml

2.5% 硝酸銀水溶液 0.5 ml

搖晃,變清,再加 2.5% 四硼酸鈉 1.5~2 ml 加蒸餾水至 30~40 ml

2、步驟:

(1)切片脫蠟至水,蒸餾水洗

(2)0.5% 高碘酸浸 15 分鐘,蒸餾水洗

(3)六胺銀液 60℃,1-2 小時,(或六胺銀液 80-90℃,半小時左右)蒸餾水洗(鏡下基底膜呈黑色)

(4)0.2% 氯化金調色數秒

(5)麗春紅淡染

(6)水速洗

(7)烘干,透明,封片。

3、結果:腎小球基底膜呈黑色,霉菌,彈力纖維及一些網狀纖維也呈黑色。

【M】

Mallory 三色法

1、步驟

(1)切片脫蠟至水

(2)0.5% 酸性復紅水溶液 1 min

(3)蒸餾水洗

(4)入下液 1-2 min

苯胺藍 0.5 g,桔黃 G 2 g,磷目酸或磷鎢酸 1 g,蒸餾水 100 ml。

(5)蒸餾水洗

(6)95% 乙醇分色

(7)脫水,透明,封片。

2、結果:膠原纖維藍色, 紅細胞桔黃色,核紅色。

Mallory 磷鎢酸~蘇木素染色法(PTAH)

1、試劑配制:

蘇木素 0.1 g 磷鎢酸 2.0 g 蒸餾水 100 ml

先將蘇木素加熱溶于 20 毫升蒸餾水, 再將磷鎢酸溶于 80 毫升蒸餾水。等蘇木素冷卻后,加入磷鎢酸溶液,混合,放置數星期后,才可使用。如急用,可加入 0.2 g 高錳酸鉀, 加速其成熟。

2、染色步驟:

(1)切片脫蠟至蒸餾水。

(2)放入 0.25% 高錳酸鉀水溶液 5 分鐘。

(3)蒸餾水洗。

(4)2.5% 草酸漂白 5 分鐘。

(5)蒸餾水洗多次。

(6)置于磷鎢酸蘇木素溶液 12~24 小時。

(7)95% 酒精快速分化,濾紙吸去剩余酒精,置 60℃ 溫箱中烘干。

(8)二甲苯透明,封固。

3、結果:纖維膠質,肌膠質,神經膠纖維,纖維素,橫紋肌等均染成藍色。膠原,網狀纖維和骨基質著黃色或磚紅色。在工作中常用于觀察橫紋以證實腫瘤細胞是否有橫紋肌分化特征。

Masson 三色染色法

1、試劑配制:

麗春紅酸性品紅液: 麗春紅 0.7 g 酸性品紅 0.3 g

蒸餾水 99 ml 冰醋酸 1 ml

苯胺藍液: 苯胺藍 2 g 蒸餾水 98 ml 醋酸 2 ml

亮綠液: 亮綠 0.2 g 蒸餾水 100 ml 冰醋酸 0.2 ml

苦味酸酒精液: 苦味酸在 95% 酒精中的飽和液 20 ml, 加 95% 酒精 10 ml

2、染色步驟:

(1)切片脫蠟至蒸餾水

(2)蘇木素染 5~10 分鐘

(3)鹽酸酒精分化

(4)流水藍化,蒸餾水洗 (蘇木素可不染)

(5)麗春紅酸性品紅液中染 5~8 分鐘

(6)蒸餾水洗

(7)1% 磷鉬酸中染 1~3 分鐘

(8)不用水洗直接入苯胺藍液或亮綠液 5 分鐘 (如染色效果不佳, 可在冰醋酸內脫色后重染)

(9)水速洗,置 60℃ 溫箱中烘干,二甲苯透明, 封固

3、結果: 膠原纖維藍色(苯胺藍復染)或綠色(亮綠復染), 肌纖維、纖維素紅色。

4、注意:

(1)此法廣泛用于膠原纖維和平滑肌的鑒別,也為腎組織活檢,觀察腎小球病變的重要染色法,常用于觀察缺血病變的心肌。 用于觀察腎小球病變時,一定要用 2um 以下半薄切片。

(2)細胞核染色后分化很重要,觀察控制著色程度。而 HE 染色則是最常用的一種常規染色方法,但無法區別膠原纖維和肌肉。

【N】

粘液染色

(一)PAS 染色法

與染糖元的方法相同。

(二)AB(pH2.5) 染色法

1、試劑配制:

愛先藍 8 GX 1 g 蒸餾水 97 ml 冰醋酸 3 ml

核固紅液: 核固紅 0.1 g 硫酸鋁 5 g 麝香草酚 50 mg 蒸餾水 97 ml

2、染色步驟:

(1)切片脫蠟至蒸餾水。

(2)愛先藍液染 10~20 分鐘

(3)蒸餾水洗

(4)核復染 (核固紅 5 分鐘),水洗

(5)脫水, 透明, 封固。

唾液酸及弱硫酸化粘液及一般粘液呈藍色。常用于確定胞漿內空泡的性質,特別是當細胞呈現印戒樣特征時。

【J】

甲基綠派洛寧法(改良 Cook,1974)

1、試劑配制:

(1)2% 甲基綠水溶液:

甲基綠(methyl green)1 g

蒸餾水加至 50 ml

用三氯甲烷抽提,方法詳后。

(2)5% 派洛寧水溶液:

派洛寧 G(pyronine G)1 g

蒸餾水加至 20 ml

(3)0.2M 醋酸鹽緩沖液(pH 4.8)

0.2M 醋酸液 41 ml

0.2M 醋酸鈉液 59 ml

(4)甲基綠派洛寧染液:

2% 甲基綠水溶液(經抽提)5 ml

5% 派洛寧水溶液 1 ml

蒸餾水 12 ml

0.2M 醋酸鹽緩沖液(pH 4.8)18 ml

甲基綠水溶液的抽提:甲基綠為綠色粉末,屬三苯甲烷染料,這種染料是由氯代甲烷作用于結果晶紫而形成的一種化合物。由于甲基化作用,甲基綠就比甲基綠后,所引進的甲基連接得并不牢固,容易從甲基綠中脫失。另一方面,在甲基化過程中,還有一部分結晶紫并沒有生成甲基綠,因此,也有人認為甲中,常有少量的甲基紫或結晶紫成份。但是,也有人認為甲基紫乃是甲基綠的衰敗產物,甲基綠在儲存過程中,會不斷產生甲基紫。因此,在配制試劑時,必須先將甲基綠所含的甲基紫或結晶紫抽提出來,才能使細胞核內的脫氧核糖核酸染成綠色。抽提方法是取 2% 甲基綠水溶液 20 ml 傾入潔凈分液漏斗,加入三氯甲烷 20 ml 充分搖蕩混合,使其內的甲基紫溶于三氯甲烷中而呈紫紅色。旋動分液漏斗下部的砂塞,慢慢把如此反復更換三氯甲烷,直到三氯甲烷無紫紅色為止,即可得到得純的甲基綠溶液。

2、操作步驟:

(1)新鮮組織固定于 Carnoy 氏液(4℃)3~6 小時,經 95% 酒精和無水酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋。

(2)切片經二甲苯脫蠟至蒸餾水。

(3)置入甲基綠派洛寧染液于室溫染 30~60 分鐘。

(4)取出切片,不經水洗,用濾紙吸干多余染液。

(5)用丙酮迅速分化。

(6)轉入丙酮二甲苯(1:1)稍洗。

(7)二甲苯透明 2~3 次。

(8)中性樹膠封固。結果:存在于胞質和核仁內的核糖核酸呈紅紫色,胞核染色質內的脫氧核糖核酸綠色或綠藍色。

3、對照方法:

(1)取另一連續切片用核糖核酸酶(rihonuclease)1 mg/1 ml 于 37℃ 溫箱內消化 3 小時,蒸餾水洗后置入甲基綠派洛寧染液內染色。

(2)切片在 10% 高氯酸(prechloric acid)于 4℃ 處理 12~18 小時,水洗后用 1% 碳酸鈉液中和 2 分鐘,流水沖洗 5 分鐘,再用蒸餾水洗后置入甲基綠派洛寧染液內染色。經上述方法之一處理后的切片就為陰性。

4、注意事項:

(1)組織不宜用甲醛固定,應選用 Garnoy 氏固定液,因為酒精和醋酸能較好地保存核蛋白。

(2)Garnoy 氏液固定標本的時間不宜太長,超過一天則染色效果不理想。

(3)要注意試劑的質量,特別是派洛寧,常常不同批號的染料,染色的效果不同。甲基綠和派洛寧二者的比例要恰當。

(4)染色液的 pH 應為 4.8 左右,如 pH 過低,甲基綠染色效果差;pH 偏高,則派洛寧染色效果不良。

(5)丙酮分化時間要很好掌握,時間不宜太長。

(6)配妥的甲基綠派洛寧染液用后放冰箱保存,約可使用數周。

染色原理:對此法的染色原理,目前了解得還不夠清楚,一般可從下面兩方面理解。

(a)電離作用:脫氧核糖核酸和核糖核酸都有磷酸基,又有堿基,故為兩性電解質。在一定的條件下,可以電離而帶電荷,因此都有一定的等電點。甲基綠和派洛寧在水中電離后,都產生帶陽電荷的離子。甲基綠電離后,在五價氮處產生二個正電荷,堿性較強。派洛寧電離后僅產生一個正電荷,堿性較甲基綠弱,在染色時二者進行競爭,堿性較強的甲基綠就與胞核(等電點 pH3.8~4.2)進行極性吸著而結合,堿性較弱的派洛寧與胞質(等電點 pH4.6~5.2)吸附結合。

(b)聚合作用:甲基綠對聚合高的 DNA 有親和力,派洛寧對聚合低的 RNA 有親和力。因此,思慮在綠選染 DNA,而派洛寧選染 RNA。應用:PNA 主要存在于胞質及核仁內,它主導細胞的蛋白質合成。在細胞增生,胞質蛋白質合成亢進時,核仁和胞質的 PNA 增加。因此,惡性瘤細胞核仁巨大,胞質嗜堿。漿細胞和免疫母細胞胞質合成免疫球蛋白,胰腺上皮合成胰蛋白酶。因此,這些細胞胞質有很強的嗜堿性。胞質嗜堿,是蛋白質合成增強的標志。

【S】

脂肪(蘇旦Ⅲ)法

1、試劑配制:

蘇旦Ⅲ 0.1~0.2 70% 酒精 100 ml

將蘇旦Ⅲ置于 70% 酒精中, 加熱飽和, 在未冷前過濾, 靜置一夜。

2、染色步驟:

(1)冰凍切片(8~10 微米)。

(2)70% 酒精固定 1 分鐘。

(3)放入蘇旦Ⅲ酒精溶液中 20~30 分鐘。

(4)70% 酒精洗去多余的染料。

(5)水洗。

(6)蘇木素復染 2~5 分鐘。

(7)1% 鹽酸酒精分化。

(8)水洗,藍化, 甘油封固。

3、結果:脂肪桔黃或紅色。一般用于確定胞漿內空泡究竟是糖原,水變性還是脂滴。

【P】

高碘酸-六胺銀-馬休黃染色法 (PASM-M)

1、試劑配制:

六胺銀原液: 3 % 六甲基四胺水溶液 (烏洛托品) 20 毫升,5 % 硝酸銀水溶液 10 毫升。

六胺銀工作液:六胺銀原液 30 毫升,雙蒸水 20 毫升,5 % 硼砂 (四硼酸鈉)2 毫升。

核固紅液:核固紅 0.1 克,5 % 硫酸鋁 100 毫升加熱溶解,貯存飽和液待用。

馬休黃液:馬體黃 0.5 克,無水酒精 98 毫升,磷酸 0.2 克。

2、操作方法:

(1)常規脫蠟至水

(2)0.5% 氧化 20 分鐘

(3)蒸餾水洗 3 次

(4)浸入六胺銀工作液中 2 小時左右 (恒溫 58℃)

(5)蒸餾水洗 3 次

(6)0.2% 氯化金 1-2 分鐘

(7)蒸餾水洗 2 次

(8)核固紅染色 10-15 分鐘

(9)馬休黃染色 1 分鐘

(10)放入溫箱烤干,二甲苯透明,中性樹膠封固

3、結果:腎小球毛細血管基膜呈黑色,背景和紅細胞呈黃色,細胞核呈紅色。

4、注意:

(1)六胺銀工作液現配現用,只能用一次。

(2)第 3 步做完后可入 5 % 三氧化鉻 (鉻酸) 水溶液氧化 40 分鐘,再用 1 % 亞硫酸鈉除鉻,背景可能效果更佳。

(3)馬休黃主要是染紅細胞。用無水酒精中脫水,黃色的背景就脫掉,可直接放入溫箱或電吹風吹干,封片。

【R】

瑞氏-姬姆薩染色方法

1、試劑配制:

原料:

A: 瑞氏染粉 0.8--1 克;吉姆薩染粉 0.5 克

B: 甘油 33 ml

C:甲醇 500 ml

配法:將 A 放入研缽中,加入少量 B 研磨,再加入少量 B 磨,再加入少量 B 磨……倒出,將未溶部分,繼續加入 B 磨……> 全溶,加入 C,或中間加入 C 亦可。

2、染色步驟:

滴數滴入玻片蓋滿標本,30 秒,再加入雙蒸水或 PBS2-3 倍染 1-3 分中,傾去染液,水洗……封片。

【T】

Trypan blue(臺盤蘭)排斥實驗:

細胞懸液 0.1 ml 加入 0.4% Trypan blue 生理鹽水溶液 0.1 ml, 混勻后滴在血球記數板上。存活率 = 不著色細胞數/細胞總數 X100%

TTC 方法:

TTC 和活細胞線粒體內的琥珀酸脫氫酶反應,生成紅色的甲月贊,用來表示細胞的活力。配制多為 2%,染色要避光,37 度條件下,它是評價腦缺血損傷常用的指標。

【V】

Van Gieson 法

1、試劑配制:

(1)飽和苦味酸水溶液(約 1.22%)150 ml

(2)1% 酸性品紅 10 ml

(3)上述兩種溶液用前混合在一起。

2、染色步驟:

(1)切片脫蠟至蒸餾水。

(2)蘇木素深染。(10~15 分鐘)

(3)Van Gieson 中染半分鐘。

(4)蒸餾水洗。

(5)置 60℃ 溫箱中烘干。

(6)二甲苯透明,封固。

3、結果:膠原纖維紅色,肌纖維、胞漿、紅細胞黃色。

4、建議:用稀釋的 Van Gieson 液進行染色,不用 95% 的酒精分化,結果色澤鮮艷,而且著色均勻。

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