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蛋白質定量實驗

2元彩票中500万的 www.chmhhq.tw 標簽: 蛋白質 定量 蛋白質純化指南 第八章

蛋白質定量實驗主要用于測定蛋白質含量。

實驗方法
  • 考馬斯亮藍蛋白質濃度分析法
  • 堿性銅還原分析法
  • 胺衍生法
實驗方法原理

蛋白質分子中的芳香族氨基酸酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基,其化學結構中的共軛雙鍵,具有吸收紫外光的特性,吸收高峰在280 nm處,蛋白質溶液的吸光度(A280)與蛋白質含量成正比關系,可作為樣品中蛋白質定量測定。該方法簡便、靈敏、快速,且樣品用量少且可回收,低濃度的鹽類也不干擾測定,但測定的準確度比Lowry法低,這是由于對于測定那些與標準蛋白質中酪氨酸和色氨酸殘基含量差異較大的蛋白質時有一定的差距。若樣品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物質,會出現較大的誤差。


實驗材料
試劑、試劑盒
儀器、耗材
實驗步驟
(1) 準備 100~1500 ug/ml 的標準品, 溶于 Bradford 法相兼容緩沖液中。對于較稀的樣品,可能通過增加樣品在試劑體積中的比率而擴大靈敏度(microBradfordassay:1~25ug/mL)。如果樣品與染料的比值太高, 可能會增加反應混合物的 PH 而導致反應背景較高。

(2) 將標準品和待測樣品加人到一次性的比色皿中 (應該使用一次性的塑料比色皿或微孔板,因為染料會黏附到各種材料容器的表面上)。

(3)Bradford 試劑預熱至室溫。將 ImL 染料溶液加人到 25 uL 蛋白質樣品中,混勻,室溫孵育 10 min。

(4) 檢測 450rnn 和 595nm 處的吸光度 (可以使用 570~610nm 的基于濾光器的儀器,對檢測性能不會有明顯的降低)。

(5) 對 595 nm 處的數據作圖,或為提高在低反應值處的精度,對 595 nm/450 nm 的比率作圖。標準反應曲線可以擬合為一個多項式反應,由此可以估算出待測樣品的濃度值.
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注意事項

1. 測定液必須澄清,否則造成測定結果誤差。


2. 由于蛋白質的紫外吸收高峰常因pH的改變而變化,故應用紫外吸收法時要注意溶液的pH,最好與制定標準曲線時的pH一致。


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試劑、試劑盒
實驗步驟
堿性銅還原分析法 (Lowry 法)(Lowryetal.,1951) 和其他能夠增強檢測性能的方法都是基于一個包括兩個步驟的過程。首先,雙縮脲反應涉及蛋白質在堿性溶液環境中將銅還原(由Cu2+ Cu+); 隨后是反應增強的階段,Folin-Ciocalteu 試劑 (憐鉬酸鹽和憐鎢酸鹽)(PeterSon,1979) 被還原后產生一種在 750nm 處有最大吸光度的藍色物質。這種檢測方法因蛋白質序列的不同而有所變化,因為顏色的產生不僅取決于還原的銅-酰胺類復合物,而且還與酪氨酸、色氨酸有關,在較小的程度上還與胱氨酸、半胱氨酸、組氨酸殘基等有關 (Peterson,1977;Wuetal.,1978)。

Lowry 法已經被改良以減少其對干擾物的敏感性、增加動態范圍、縮短檢測時間以及產生穩定的顏色生成物 (Peterson,1979)。有許多商業來源的改良 Lowry 法 (Roche、Pierce、Bio-Rad 和 Sigma),但不同的制劑可能不會得到相同的結果數據,即便是使用相同的標準品、稀釋緩沖液或存在相同的干擾物質。

1.向 1 mL 含量為 5~100pg/mL 的一系列蛋白質標準品及該濃度范圍內的待測樣品中分別加入 ImL 堿性銅試劑,混勻, 室溫放置 10 min。

2.加人 0~5 mL Folin-Ciocalteu 試劑混合物,禍旋使之充分混勻,孵育 30 min。

3.孵育完成后再次渦旋混勻,檢測 750mn 處的吸光度。

吸光度的讀取范圍可以從 650~750nm, 這取決于可用的合適的濾光器 (酶標儀),或者,如果信號太強,不會對檢測性能產生顯著的影響。Lowry 法不是端點檢測(endp0intassay),所以樣品檢測應該交錯進行以獲得更精確的測量值。

4.在有限的標準品濃度范圍內觀察到的反應將是線性的??捎枚嘞釷?、指數和對數模型擬合數據以擴大反應曲線的動態范圍。

上述的 Lowry 法可適應于微孔板,以減少所加人反應物的體積,產生的動態為 50~500 ug/mL。由于靈敏度、線性及方法學上的進步,Lowry 法已基本被 BCA 法所取代。

Lowry 法對許多干擾性化合物敏感 (表 8.1),對于這些物質可能不會產生線性反應 (因而導致要推斷復雜的干擾數據)。去污劑、脂類、鉀離子和磷酸鈉的存在會導致沉淀產生。
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試劑、試劑盒
實驗步驟

1.于分析前至少 30 min 將 15uL 2-巰基乙醇加人到 5 mL OPA 儲存液中, 這一試劑可穩定維持一天。所有熒光樣品和相關反應在所有時間內都需要避光。

2.蛋白質標準品 (0.2~10 ug/mL) 和未知濃度的待測樣品在分析前需要調節 pH 至 8.0-10.5。將 10 檢測樣品與 1 00xLOPA 儲存液 (含 2-巰基乙醇) 混合,于室溫下孵育 15 min。

3.加入 3 mL 0.5mol/L 的 NaOH, 混勻。

4.在激發光為 340nm, 發射光為 440~455nm 處,于熒光比色皿內對熒光進行讀數。

5.在檢測的動態范圍內蛋白質濃度和熒光之間的聯系應該是線性的,可以用來估計未知樣品的濃度。

注釋

相比基于吸光度的蛋白質定量分析方法,這 3 種染料都提供了更好的靈敏度和動態范圍。由于染料在水溶液中的水溶性和穩定性更佳,所以 OPA 檢測法普遍優于熒光胺檢測法。

使用胺衍生試劑對蛋白質進行定量具有一定的局限性,因為該檢測方法顯示出很大的蛋白質與蛋白質間的變異性,其原因是蛋白質中賴氨酸殘基的數量不同,同時它需要一個「匹配」的標準品。該檢測方法易被緩沖液中含有的甘氨酸、胺、銨離子和許多生物緩沖液中常見的硫醇所干擾,因而限制了它的應用(表 8.1)。檢測的重復性取決于反應的 pH、蛋白質樣品是否含有殘余的酸性物質等。例如,來自于沉淀操作的樣品,可減少胺的衍生率 (Youetal.,1997)。

一種非共價的胺活性染料—Epicocconone,也可用于溶液中總蛋白質量的檢測 (Sigma),這一方法的機制已有報道 (BellandKaruso,2003;Coghlanetal.,2005)。

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  • dxy_8i9kkxy0

    dxy_8i9kkxy0

    3個月前 覺得難

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  • solonye

    solonye

    3個月前 覺得簡單

    蛋白質的傳功定量實驗很簡單,但是也很重要,可以解決絕大部分的實驗和需求。但是目前越來越多的定量蛋白質組實驗,一般的定量已經達不到要求了,比如說DIGE和iTRAQ等實驗,上樣量精確到0.幾個微克,所以需要用到QUBIT等專門的定量儀器并結合試劑盒

  • lilinling203

    lilinling203

    3個月前 覺得很簡單

    做的并不好

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