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慢病毒包裝實驗

2元彩票中500万的 www.chmhhq.tw 標簽: 慢病毒 包裝

慢病毒載體包裝之后成為假病毒顆粒后,可用于:(1)感染原代培養細胞;(2)制備穩定表達/沉默特定基因的單克隆細胞株;(3)in vivo的基因操作、轉基因動物,特別是轉基因大鼠的制備。

詳細
實驗方法
  • 慢病毒包裝實驗
實驗方法原理 慢病毒是反轉錄病毒的一種,具有反轉錄病毒的基本結構和特性:整合入宿主細胞基因組,長期表達,可用于轉基因動物制備;但也有不同于反轉錄病毒的組份和特性:比反轉錄病毒具有更高的滴度,不僅可以感染分裂期細胞,更重要的,還能感染非分裂期的細胞。利用慢病毒載體,可以研究啟動子的調控、過表達特定基因或沉默特定基因。
實驗材料
試劑、試劑盒
儀器、耗材
實驗步驟
以六孔板中的1孔為例,每個樣品需要1x106個293T細胞。
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1. 取1.5ml滅菌EP管,加入1.5ug包裝混合質粒和0.5ug表達質粒以及250ul的無血清培養基。輕柔混勻,室溫孵育5min。
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2. 取1.5ml滅菌EP管,取9ul 脂質體2000l溶于250ul無血清培養基中。輕柔混勻,室溫孵育5min。
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3. 將DNA溶液和脂質體溶液輕柔混勻。室溫孵育20min
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4. 用胰酶消化并記數293T細胞。用含血清的培養基重懸細胞。
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5. 在六孔板中每孔,加入1ml含血清的生長培養基,再加入DNA-脂質體復合物。
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6. 將1ml重懸的293T細胞(1x106個細胞/ml)加入到平板中。37℃ CO2孵箱中孵育過夜。
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7. 移除含有DNA-脂質體復合物的培養基移除,代之以DMEM(含丙酮酸鈉和非必須氨基酸)。
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8. 轉染后48-72h收獲含病毒的上清。3000 rpm 離心20min,去除沉淀。
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9. 病毒上清-80℃貯存。
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包裝出來的慢病毒對NIH/3T3細胞達90%以上感染效率。
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注意事項

1.慢病毒理論上可以包裝5~7Kbp的片段,但過大的片段包裝會影響病毒的出毒效率,導致獲得的病毒滴度較低,影響病毒感染效果。因此一般建議最好將包裝的片段控制在1.5Kbp以內。

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2.病毒載體易突變和丟失,克隆過程中可能出現質

粒的包裝信號突變或大小不等的片段丟失,導致無法成功包裝出病毒。因此建議構建好含有目的基因的克隆載體(尤其插入片段大于1.5Kbp)后首先進行測序,以確保關鍵序列都正確無誤。

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3.包裝細胞多選擇為293T或293FT。要求細胞生長旺盛、狀態良好,避免過密生長和體外傳代次數過多。

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4.轉染時對質粒純度要求較高,最好為去掉內毒素

的超螺旋質粒,以提高轉染效率。多采用磷酸鈣轉染方法,既節約成本又可獲得高的轉染效率(一般可達到80%~95%)。

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5.無論是三質?;蛩鬧柿B《鞠低?,轉染的各質

粒之間的比例非常重要,直接影響出毒效率。不同公司提供的質粒有所差別,因此無法一概而論,需要根據給出的比例進行調整優化。


6.轉染前,細胞密度控制在50%~60%為佳。轉染前4~8h換液,轉染后不換液。轉染第2天添加丁酸鈉(TPA)可明顯提高出毒率,之后8h再換液。每次換液前應將培養基預熱至37℃,換液時動作輕柔以防細胞漂起。


7. 一般情況下,轉染48h后收獲得到的病毒顆粒最多,但也與當時細胞狀態、生長速度和培養基pH值有關。收獲病毒時培養基應呈紅色,若過酸呈現黃色則會降低病毒收獲率。

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8. 不同廠家和批次的血清對病毒的產量影響很大,

需要篩選。

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9.病毒液避免反復凍融,否則明顯降低效率。

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10.一般情況下,病毒液于-80℃中可保存1年,但建議半年之后重新檢測病毒滴度。

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其他
構建慢病毒載體的過程比較復雜,自己構建既費時又費錢,一般情況下委托生物公司代為構建比較好。目前國內已有公司提供慢病毒的包裝,研究人員只需將欲包裝的基因序列號或堿基序列提供給公司,即可在2~3個月內拿到純化好的3×107—30×107Tu的病毒顆粒,可直接用于細胞水平或動物體內實驗,所有費用約為1.8萬。

來源《腫瘤分子生物學與細胞生物學實驗手冊》,《細胞與分子生物學常用實驗技術》。
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