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細胞轉染

2元彩票中500万的 www.chmhhq.tw 標簽: 細胞轉染 外源基因 瞬時轉染

細胞轉染可應用于:(1)真核細胞可以摻入外源DNA而獲得新的遺傳標志;(2)轉基因動植物;(3)生物制藥、基因治療、RNA干擾。

詳細
實驗方法
  • 脂質體介導法
  • 磷酸鈣沉淀法
實驗方法原理

外源基因進入細胞主要有四種方法:電擊法、磷酸鈣法和脂質體介導法和病毒介導法。電擊法是在細胞上短時間暫時性的穿孔讓外源質粒進入;磷酸鈣法和脂質體法是利用不同的載體物質攜帶質粒通過直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因進入細胞;病毒法是利用包裝了外源基因的病毒感染細胞的方法使得其進入細胞。但是由于電擊法和磷酸鈣法的實驗條件控制較嚴、難度較大;病毒法的前期準備較復雜、而且可能對于細胞有較大影響;所以現在對于很多普通細胞系,一般的瞬時轉染方法多采用脂質體法。

上圖所示是脂質體介導轉染的示意圖,它顯示了外源質粒進入細胞的一般過程。

利用脂質體轉染法最重要的就是防止其毒性,因此脂質體與質粒的比例,細胞密度以及轉染的時間長短和培養基中血清的含量都是影響轉染效率的重要問題,通過實驗摸索的合適轉染條件對于效率的提高有巨大的作用。

上圖是本次實驗采用的脂質體中陽離子組分的結構的示意圖。

本次實驗采用的脂質體是promega公司的TransFast脂質體試劑,它是一種陽離子脂質體和中性脂質體的混合物,是對于本次實驗中采用的293T細胞優化的轉染試劑。

實驗材料
試劑、試劑盒
儀器、耗材
實驗步驟

一、細胞傳代


1.? ?試驗準備:200 ul/1mlTip頭各一盒(以上物品均需高壓滅菌),酒精棉球,廢液缸,試管架,微量移液器,記號筆,培養皿,離心管。


2.? ?棄掉培養皿中的培養基,用1 ml的PBS溶液洗滌兩次。


3.? 用Tip頭加入1 ml Trypsin液,消化1分鐘(37℃,5%CO2 )。用手輕拍培養瓶壁,觀察到細胞完全從壁上脫落下來為止。


4.? ?加入1 ml的含血清培養基終止反應。


5.? ?用Tip頭多次吹吸,使細胞完全分散開。


6.? 將培養液裝入離心管中,1 000 rpm離心5 min。


7.? ?用培養液重懸細胞,細胞計數后選擇0.8X106個細胞加入一個35mm培養皿。


8.? 將合適體積完全培養液加入離心管中,混勻細胞后輕輕加入培養皿中,使其均勻分布。


9.? 將培養皿轉入CO2培養箱中培養,第二天轉染。


二、細胞轉染


1.? 轉染試劑的準備


(1)將400 ul去核酸酶水加入管中,震蕩10秒鐘,溶解脂狀物。


(2)震蕩后將試劑放在-20℃保存,使用前還需震蕩。


2.? ?選擇合適的混合比例(1:1-1:2/脂質體體積:DNA質量)來轉染細胞。在一個轉染管中加入合適體積的無血清培養基。加入合適質量的MyoD或者EGFP的DNA,震蕩后在加入合適體積的轉染試劑,再次震蕩。


3.? 將混合液在室溫放置10-15分鐘。


4.? 吸去培養板中的培養基,用PBS或者無血清培養基清洗一次。


5.? 加入混合液,將細胞放回培養箱中培養一個小時。


6.? 到時后,根據細胞種類決定是否移除混合液,之后加入完全培養基繼續培養24-48小時。


三、第二次細胞傳代


1.? ?在轉染后24小時,觀察實驗結果并記錄綠色熒光蛋白表達情況。


2.? ?再次進行細胞傳代,按照免疫染色合適的密度0.8X105個細胞/35 mm培養皿將細胞重新粉入培養皿中。


3.? ?在正常條件下培養24小時后按照染色要求條件固定。


4.? 轉染條件優化可以參考TransFast的使用說明書。


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注意事項
利用脂質體轉染法最重要的就是防止其毒性,因此脂質體與質粒的比例,細胞密度以及轉染的時間長短和培養基中血清的含量都是影響轉染效率的重要問題,通過實驗摸索的合適轉染條件對于效率的提高有巨大的作用。
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其他
一、研究進展

1. ?轉染技術
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國際上推出了一些陽離子聚合物基因轉染技術,以其適用宿主范圍廣,操作簡便,對細胞毒性小,轉染效 ?轉染試劑率高受到研究者們的青睞。其中樹枝狀聚合物(Dendrimers)和聚乙烯亞胺(Polyethylenimine,PEI)的轉染性能最佳,但樹枝狀聚合物的結構不易于進一步改性,且其合成工藝復雜。聚乙烯亞胺是一種具有較高的陽離子電荷密度的有機大分子,每相隔二個碳個原子,即每第三個原子都是質子化的氨基氮原子,使得聚合物網絡在任何pH下都能充當有效的;質子海綿(protonsponge)體。這種聚陽離子能將各種報告基因轉入各種種屬細胞,其效果好于脂質聚酰胺,經進一步的改性后,其轉染性能好于樹枝狀聚合物,而且它的細胞毒性低。大量實驗證明,PEI是非常有希望的基因治療載體。目前在設計更復雜的基因載體時,PEI經常做為核心組成成分。
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2. ?轉染效率
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線型PEI(LinePEI,LPEI)與其衍生物用作基因轉染載體的研究比分枝狀PEI(BranchedPEI,BPEI)要早一些,過去的研究認為在不考慮具體條件,LPEI/DNA轉染復合物的細胞毒性較低,有利于細胞定位,因此與BPEI相比應該轉染效率高一些。但最近研究表明BPEI的分枝度高有利于形成小的轉染復合物,從而提高轉染效率,但同時細胞毒性也增大。超高分枝的、較柔性的PEI衍生物含有額外的仲胺基和叔胺基,在染實驗中發現這種PEI的毒性低,但轉染效率卻較高。
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GenEscort是采用各種分枝狀和超高分枝狀的小分子PEI與各種含有生理條件下可降解鍵的交聯劑交聯,合成出的一系列高分枝的可降解的PEI衍生物。聚合物的分枝結構使得其具有較高的正電性,因此易于高效地包裹各種DNA、RNA分子及質粒形成小的納米顆粒,從而提高轉染效率,當所形成復合物進入細胞以后,其中所含的生理條件下可降解的化學鍵在細胞內水解,使交聯聚合物分解為無細胞毒性的小分子PEI,這樣結構的轉染試劑在體外應用可以獲得高的轉染效率和低的細胞毒性,其可降解性對體內應用也具有重要的意義。
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實驗方法原理 酸鈣沉淀法是基于磷酸鈣-DNA復合物的一種將DNA導入真核細胞的轉染方法,磷酸鈣被認為有利于促進外源DNA與靶細胞表面的結合。磷酸鈣-DNA復合物粘附到細胞膜并通過胞飲作用進入靶細胞,被轉染的DNA可以整合到靶細胞的染色體中從而產生有不同基因型和表型的穩定克隆。這種方法首先由Graham和vander Ebb使用,后由Wigler修改而成??曬惴河糜謐拘磯嗖煌嘈偷南赴?,不但適用于短暫表達,也可生成穩定的轉化產物。
實驗材料
試劑、試劑盒
儀器、耗材
實驗步驟

1.傳代細胞準備 


細胞在轉染前24 h傳代,待細胞密度達50%~60%滿底時即可進行轉染。加入沉淀前3~4 h,用9 ml完全培養液培養細胞。

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2.DNA沉淀液的準備 


首先將質粒DNA用乙醇沉淀(10~50 μg/10cm平板),空氣中晾干沉淀,將DNA沉淀重懸于無菌水中,加50 μL2.5 mol/L CaCl2。

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3.用巴斯德吸管在500 μL 2×HeBS中逐滴加入DNA-CaCl2溶液,同時用另一吸管吹打溶液,直至DNA-CaCl2溶液滴完,整個過程需緩慢進行,至少需持續1~2 min。

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4.室溫靜置30min,出現細小顆粒沉淀。

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5.將沉淀逐滴均勻加入10 cm平板中,輕輕晃動。

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6.在標準生長條件下培養細胞4~16 h。除去培養液,用5 ml 1×HeBS洗細胞2次,加入10 ml完全培養液培養細胞。

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7.收集細胞或分入培養皿中選擇培養。

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注意事項
1. ?在整個轉染過程中都應無菌操作。
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2. ?為獲得最佳實驗結果,DNA應不含蛋白質和酚。乙醇沉淀后的DNA應保持無菌,并在無菌水或Tris EDTA中溶解。
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3. ?沉淀物的大小和質量對于磷酸鈣轉染的成功至關重要。在磷酸鹽溶液中加入DNA-CaCl2溶液時需用空氣吹打,以確保形成盡可能細小的沉淀物,因為成團的DNA不能有效地粘附和進入細胞。
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4. ?在實驗中使用的每種試劑都必須小心校準,保證質量,因為甚至偏離最優條件十分之一個pH都可能導致磷酸鈣轉染的失敗。
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其他
這種方法首先由Graham和vander Ebb使用,后由Wigler修改而成??曬惴河糜謐拘磯嗖煌嘈偷南赴?,不但適用于短暫表達,也可生成穩定的轉化產物。
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誰能提供實驗幫助?
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  • 夢飛舞心飛揚

    夢飛舞心飛揚

    3個月前 覺得簡單

    這個實驗需要摸索,而且一定要細心。

  • playojoke

    playojoke

    3個月前 覺得很難

    實驗細節較詳細,按照基本流程操作可以成功,但需要根據具體情況作調整!

  • Martinflyheart

    Martinflyheart

    3個月前 覺得難

    還沒做過,看看

  • system001

    system001

    3個月前 覺得很難

    實驗很好

  • tianlanruhai

    tianlanruhai

    3個月前 覺得一般

    需要做這部分了,沒接觸過。。

  • 小翼0311

    小翼0311

    3個月前 覺得難

    覺得寫的步驟很清楚,謝謝分享

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